1:健康  2：产后  3、4:早期
    
                         5、6:中期  7、8:晚期  M：marker
    
                          图1  亚硫酸氢钠转化后APC基因
  
                             扩增产物的琼脂糖电泳结果
   
    2.2  基因芯片的杂交结果
   
    2.2.1  中期妊娠和健康未孕样品中APC启动子区甲基化模式比较  图2中2与5显示其芯片扫描结果，由图中可见，在妊娠中期c、d探针上杂交点的信号相对较强，在未孕妇女样本中荧光强度值较弱，杂交扫描后s-median 532值组间方差分析表明差异有显著性(P<0.05)，说明 APC基因在健康妇女血浆中是低甲基化或未甲基化的，而在妊娠状态下是高甲基化的。从而表明妊娠对血浆DNA甲基化程度有着较多的影响，妊娠妇女与健康未孕妇女的甲基化状态有比较明显的差异。DNA甲基化作为一种新的产前诊断的标志物可以应用于产前诊断，为无创性产前诊断的发展打下了基础。

     图中a、b、c、d、e、f分别表示APC启动区不同CpG位点AP1、AP2、AP3、AP4、AP5的杂交结果，
   
         1、2、3、4、5代表妊娠的早期、中期、晚期、产后1周、健康未孕五种妊娠状态。
    
                        图2  妊娠各时期芯片杂交结果

                    图3  妊娠各期与健康未孕妇女APC启动
    
                    子区不同CpG位点荧光信号图谱及分析
   
    2.2.2  不同妊娠时期及未孕样品中APC启动子区甲基化模式比较  笔者进一步对不同妊娠时期APC甲基化变化情况进行了比较，见图2妊娠各时期芯片杂交结果及图3妊娠各期与健康未孕妇女APC启动子区不同CpG位点荧光信号图谱及分析。妊娠中期和晚期样品检测结果中APC基因的甲基化状态有相似的模式，而在妊娠早期有较大的差异，杂交扫描后s-median 532值SNK分析表明早、中、晚妊娠期b探针上差异有显著性(P<0.01)，说明不同的妊娠时间APC基因的甲基化模式程度有所不同；在产后样品中，APC基因的甲基化消失迅速，方差分析表明其与未孕样品之间差异无显著性(P>0.01)，说明其与健康样品具有相似的甲基化模式。
   
    3  讨论
   
    自Lo等首次报道母体血浆中的DNA是胎儿和母体DNA的嵌合物后。大多数研究者依靠外周血浆中胎儿特异性标志物，已将胎儿DNA应用于诊断性别和性连锁疾病、Rh血型的鉴定、β-地中海贫血、父源性遗传性疾病的诊断、非整倍体疾病的诊断、妊娠并发症的筛选。另外，孕妇血浆中胎儿DNA含量的检测也已在21-三体综合征、惊厥、早产等一系列疾病中应用。这些研究均表明了孕妇外周血浆DNA分析对于各种疾病产前诊断的潜在应用价值。但以往对孕妇外周血中检测的胎儿基因必须能与母亲DNA 序列显著区分开来，这种限制性的存在是由于母亲血浆和血清中的胎儿DNA 处于一种母体DNA 背景过多的环境中。所以，当前Y染色体上DNA的分析不能应用于50％的女性胎儿。Poon等［2］等提出表遗传在母血和胎儿中的不同为产前诊断提供了新的思路。Chim等［4］研究证明maspin基因启动子区在胎盘组织是低甲基化的，在孕妇外周血细胞是高甲基化的。同时，通过实时定量甲基化特异性PCR，在妊娠的所有时期都检测到了maspin基因序列，在分娩24h后被清除。本实验对不同妊娠时期以及健康未孕妇女外周血浆中APC基因甲基化模式的差异进行了分析比较，以期对所有的胎儿进行产前诊断。研究发现健康未孕妇女血浆中APC基因是未甲基化或低甲基化的，而在妊娠各时期均成高甲基化状态，在不同时期甲基化程度有所不同。孕妇外周血浆中APC甲基化模式的变化与妊娠状态和时间均有一定的关系，妊娠的不同时期，孕妇外周血浆中APC基因甲基化的模式有所不同。产后孕妇血浆DNA甲基化模式与健康未孕妇女的甲基化模式类似，且迅速消失［5］，这与遗传标志物DYS基因在妊娠时的变化具有相似性，从而说明孕妇外周血浆DNA甲基化模式的变化与妊娠时孕妇外周血中胎儿DNA的存在与含量有关。产后胎儿DNA迅速消失，而其甲基化状态也随之发生了改变。研究结果与前人研究相符。
   
    Poon等利用甲基化特异性PCR、测序或引物延伸法来分析母亲和胎儿之间DNA甲基化差异。但这些甲基化分析方法仅仅能分析少量的已知基因，这大大延缓了甲基化的研究进程。笔者选择基因芯片方法对孕妇血浆DNA的甲基化进行了检测，该技术能同时分析基因启动子上的多个甲基化位点的甲基化模式。基因芯片上各位点荧光信号强弱所代表的甲基化模式及其规律性可以用来作为生理或病理状态下的标志物。
   
    本实验对健康妇女以及妊娠不同时期妇女的外周血浆DNA甲基化模式的检测为甲基化在产前诊断中的应用奠定了基础。DNA的甲基化可以作为一种新的产前诊断标志，为无创性产前诊断的进一步发展提供了新的途径。
    
                                       【参考文献】
   
    1  Lo YM， Corbetta N， Chamberlain PF， et al. Presence of fetal DNA in maternal plasma and serum. Lancet， 1997， 350(9076):485-487.
   2  Poon  LL， Leung TN， Lau TK， et al. Differential DNA methylation between fetus and mother as a strategy for detecting fetal DNA in maternal plasma. Clin Chem， 2002， 48 (1): 35-41.
   3  Muller HM， Ivarsson L， Schrocksnadel H， et al. DNA methylation changes in sera of women in early pregnancy are similar to those in advaced breast cancer patients. Clin Chem， 2004， 50(6): 1065-1068.
   4  Chim SS， Tong YK， Chiu RW， et al. Detection of the placental epigenetic signature of the maspin gene in maternal plasma. Proc Natl Acad Sci， 2005， 102(41):14753-14758.
   5  Kolialexi A， Tsangaris GT， Antsaklis A， et al. Rapid clearance of fetal cells from maternal circulation after delivery. Ann N Y Acad Sci， 2004， 1022:113-118.

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