3.3 利什曼原虫

　　利什曼原虫(Leishmania)属动基体目寄生原虫，其所有mRNA的5´端也均含有一共同的由35个核苷酸组成的小外显子(5'-AC-CGCUAUAUAAGUAUCAGUUUCUGUACUUUAUUG-3')，这为AON提供了极好的作用靶位[37]。Ramazeilles等研究表明[38]，以小外显子为靶的16 nt PS AON(5'-CTGAT-GCTTATATAGC-3')能选择性地杀死培养鼠巨噬细胞中无鞭毛体，而对宿主巨噬细胞无损害。当16nt pS AON浓度为10μmol/L时，约30％感染巨噬细胞在培养后24小时好转。为进一步提高细胞对AON的摄入，将16nt pS AON与软脂酸连接，并与人的低密度脂蛋白(LDL)混合，用于体外感染巨噬细胞测试。结果表明，当浓度约为10μmol/L时，与LDL结合的16nt pS AON使41％±5％细胞治愈，而未结合LDL的16 nt PS AON只有25％±4％细胞治愈，推测LDL可能有利于细胞对AON的内吞作用。

　　与上述结果相似，Chaudhuri等报道以5'端小外显子序列为靶的17nt pS AON(5'-CTGATACTTATATAGCG-3')同样能选择性地高效杀死培养鼠感染巨噬细胞中的无鞭毛体，须对巨噬细胞无任何损伤[38]。为促进宿主细胞对17nt pS AON的摄取，Chaudhuri很巧妙地利用受体介导技术将AON特异呈递到靶作用位点。由于哺乳动物巨噬细胞丰富的净化受体(scavenger receptor)[39,40]，这些受体能特异结合并降解经修饰的LDL，且与牛血清白蛋白(MBSA)人工配体有很高的亲和力，灾样为AON特异作用于巨噬细胞创造了条件[41]。首先是用MBSA覆盖已包裹17nt pS AON的脂质体，后者通过MBSA配体与巨噬细胞上净化受体特异结合，摄入巨噬细胞内后，随着脂质体的降解，AON即被释放出来。利用这种受体介导呈递技术，大大提高了AON作用效果。在17nt pS AON浓度为10μmol/L时，有MBSA和脂体包裹的AON能在5小时内杀死90％以上培养巨噬细胞的虫体，而未进行上述包裹的AON杀虫率只有20％。不难看出，这种由受体介导的内吞作用为反义RNA定向转运提供了可靠运载工具，它可将反义RNA定向、高效、低毒和安全地运送到靶细胞中充分发挥作用，避免了细胞外降解、非特异性摄入和安全性等问题，无疑是非常有前景的发展方向[41,42]。

　　Hoerauf等成功地应用反义核酸技术分析环孢多肽A(cyclosporin a，CsA)与环孢多肽A结合蛋白(cyclophilin)二者在利什曼原虫感染中相互作用机制[43]。在此之前，CsA对利什曼原虫的作用是通过宿主细胞中cyclophilin还是虫体是的cyclophilin介导，始终未能明了。为此，Hoerauf首先从利什曼原虫分离纯化了2个分子量分另为20kDa和22kDa的cycolphilin，并进行了N'端测序。有趣的是，尽管它们的酶活性均受到CsA抑制，但用CsA预处理后的利什曼原虫对巨噬细胞感染率并未降低，由此看来CsA不能与利什曼原虫自身cyclophilin结合。为此，作者利用反义核酸技术和动物模型，首先合成针对鼠宿主巨噬细胞cyclophilin的AON，并在感染虫体前加入到巨噬细胞培养基中，结果巨噬细胞cyclophilin的表达和细胞内无鞭毛体的增殖均受到明显抑制，充分证明宿主细胞cyclophilin在虫体的细胞内增殖机制中发挥重要作用，首次阐明宿主细胞cyclophilin对细胞内利什曼原虫存活具有重要意义。

　　3.4　其它原虫

　　Ankri等利用反义RNA抑制溶组织内阿米巴(entamoeba histolytica)半胱氨酸蛋白酶基因表达[44]，结果筛选并获得一稳定转化虫株，其半胱氨酸蛋白酶活性90％被抑制。该转化虫株在Diamond培养基中生长速率正常，致细胞病变效应和溶组织活性与对照组转化虫株相同，但其吞噬作用则明显被抑制。

　　4　展 望

　　反义核酸在寄生虫学领域中应用还刚刚起步，不可避免地碰地许多有待解决的问题：1)目前的实验结果仅限于体外实验，多数处于体外培养水平，动物模型和体内的作用尚不得而知；2)现有研究多为AON，毕竟依赖人工合成，开展反义表达载体和ribozyme于抗寄生虫研究甚为必要；3)定向打靶问题。反义核酸如能专一地定向进入靶细胞发挥作用，必将提高其作用效果，开展诸如受体介导的定向转移技术研究势在必行。总之，由于反义核酯具有许多其它药物不可比拟的特性，它在寄生虫学中的应用前景不可估量，特别是对于提示寄生虫学中某些长期悬而未决的机制具有很大潜力。随着研究的不断深入，当人们成功地驾驭这种技术时，必将造福广大人类。

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