摘要  聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)技术已在分子生物学和医学诊断等方面得到广泛的应用，形成了一种新的技术体系。PCR生物芯片作为实现PCR技术的一种重要工具有广阔的应用前景。本文论述了PCR技术的原理、特点及应用和PCR生物芯片的研究进展。
　　关键词  聚合酶链式反应  生物芯片  原理  应用  进展 
 
PCR technology and PCR biochip  QI Heng,CHEN Tao(College of Laser Engineering,Beijing University of Techn-ology,Beijing 100022,China)
 
　　Abstract  Polymerase chain reaction(PCR)technology has been successfully used in modern molecular biology and clinic diagnostic.It has been established as a new technical system.As an important tool of PCR technology,PCR biochip has an extensive and prosperous future.The principle,feature,application of PCR technology and the develo-pment of PCR biochip are introduced.
 
　　Key words  Polymerase chain reaction (PCR);Biochip;Principle;Application;Development
 
1  引言
 
　　20世纪50年代，Watson和Crick提出DNA分子的双螺旋结构学说，启动了分子生物学以及重组DNA技术的发展。现在,分子生物学已成为生命科学基础研究领域中的带头学科，并引起生命科学各分支学科的革命性发展。其中，聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)技术，是最典型的例子。PCR技术是由美国PE-Cetus公司的Kary Mullis等人在1985年建立起的一套大量快速扩增特异DNA片段的系统[1]。它是体外特定核酸序列扩增技术，在很大程度上代替了传统的DNA克隆方法。 利用该技术能够从复杂的DNA分子群体中选择性地复制一段特异的序列,使某一DNA片段得到特异性的扩增。PCR技术以其特异性强、灵敏度高、快速、准确、 重复性好等优点很快地成为临床实验诊断学的一个技术热点。通过PCR技术，可在几小时内将一个分子的遗传物质成百万乃至上亿倍的复制。目前,PCR技术已经成为分子生物学中强有力的工具，并不断开拓新的应用领域，包括从基因组DNA和cRNA直接克隆目的基因、体外诱变和DNA工程、遗传指纹鉴定、传染病源分析、基因序列变异分析和许多非生物领域等。
 
2  PCR技术基本原理
 
　　PCR技术是在模板DNA、引物和四种脱氧核糖核苷酸存在下,依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。DNA聚合酶以单链DNA为模板，借助一小段双链DNA来启动合成，通过一个或两个人工合成的寡核苷酸引物与单链DNA模板中的一段互补序列结合，形成部分双链。在适宜的温度和环境下,DNA聚合酶将脱氧单核苷酸加到引物3′-OH末端，并以此为起始点，沿模板5′→3′方向延伸，合成一条新的DNA互补链。PCR反应的基本成分包括：模板DNA(待扩增DNA)、引物、4种脱氧核苷酸(dNTPs)、DNA聚合酶和适宜的缓冲液。
 
　　PCR反应中，通过双链DNA的高温变性(denaturation)、引物与模板的低温退火(annealing)和适温延伸(extension)三步反应反复循环。每一循环中所合成的新链，又都可作下一循环中的模板。PCR合成的特定DNA序列产量随着循环次数呈指数增加，从而达到迅速大量扩增的目的［2］。
 
3  PCR技术的特点［3］
 
3.1  PCR技术的优点
 
　　高度特异性:PCR扩增只会对与引物序列互补的模板进行特异的扩增，它的特异性要大大优于免疫学方法。
 
　　高度敏感性：可以扩增一个分子的模板，灵敏度超过其它方法。
 
　　快速性：整个扩增反应在几十分钟到1～2小时内即可完成。
 
　　普适性：核酸分子是生物个体最基本、最重要的组分之一，是遗传密码的载体,PCR技术检测某种生命个体的过程，实际上是通过阅读遗传密码来识别生命个体。因此这一方法对于任何生物都适用。
 
　　对样品的耐受性较好：核酸分子的化学稳定性较好，因此保存几十年的石蜡切片，甚至古尸都可以进行DNA扩增。
 
3.2  PCR技术的缺点  PCR技术是一个灵敏度非常高的检测方法,因此操作不当时,会因为污染而产生假阳性结果,这是PCR技术的一个主要缺点。主要的污染源是被称为扩增子(Amplicon)的扩增产物DNA片段,这些小片段在干燥后可悬浮于空气中形成所谓的气溶胶，PCR实验室存在这样的气溶胶时,就会出现假阳性。为了克服这一缺点，发明了UTP-UNG酶系统，在PCR反应体系中用dUTP替代dTTP，扩增产物片段中的T全部被U取代,此时扩增产物可以被UNG酶水解。扩增前先用UNG酶处理,反应体系就可大大减低扩增子污染导致的假阳性。
 
4  PCR技术的应用
 
　　随着人们对PCR基本原理的认识和技术的掌握，通过对PCR技术的大量改进，派生发展出一系列新的相关技术和改良方法，使PCR技术的实用性得到不断的延伸、补充和发展。
 
　　目前主要有：反转录PCR(RT-PCR)、不对称PCR(Asymmetric PCR)、多重PCR(Multiple Primer PCR)、加端PCR(Add-PCR)、兼并引物PCR(Degenerate Primer PCR)、标记PCR(Labeled primers PCR)、PCR-RFLP(PCR-Restriction Fragment Length Polymorphism)、单链构型多态性PCR(SSCP-PCR)、重组PCR(Recombinant PCR)、 重组环化PCR(Recombinant circle PCR)、RAPD-PCR(Random Amplified Polymorphic DNA)、 错配PCR(mismatched PCR)、 原位PCR(insitu PCR)、定量PCR(Quantitative PCR)、DDRT-PCR(Differential Display RT-PCR)、免疫PCR(Immuno-PCR)、易错PCR(error-prone PCR)、巢式PCR(NEST PCR)、锚定PCR(A-nchored PCR)和复合PCR(Multiplex PCR)等多种PCR技术方法［4，5］。
 
　　现在，即使是非分子生物专业研究者,也能够迅速掌握并运用PCR技术，加速发展本专业的分子水平研究，从而全面推动生命科学基础研究、生物医学、法医学和考古学等诸多领域向“分子”学科发展。
 
4.1  在医学上的应用
 
4.1.1  病原体的检测  由于PCR操作自动化，其敏感性和特异性都优于传统的生物测定法和免疫测定法，尤其对那些难于培养的病原体及受染细胞很少的潜伏病毒感染,该技术的应用更有意义。PCR技术使肝炎病毒的诊断从血清抗体检查进入到了对DNA、 RNA诊断的分子生物学阶段。PCR技术是目前早期诊断病毒性肝炎和药物治疗肝炎效果评价的最好方法。国内已生产出乙肝病毒、丙肝病毒、结核杆菌等PCR诊断试剂盒。
 
4.1.2  基因病诊断  PCR技术在基因疾病诊断上的应用主要通过：①对扩增产物用打点杂交或限制性内切核酸酶酶解方法确定已知的点突变；②对扩增产物直接测序发现已知或未知突变；③通过对用特定引物所获得的大小不同扩增产物进行分析、或未能进行特异性扩增以发现异常缺失；④对DNA多态性连锁分析,间接诊断致病突变。
 
　　使用PCR技术,采取胎儿羊水细胞和绒毛为标本进行扩增分析，可对胎儿的地中海贫血症作出诊断，杜绝患儿出生。同样，用PCR技术进行血友病的产前诊断，对减少患病胎儿出生也具有重要意义。
 
4.1.3  肿瘤研究  PCR技术主要用于肿瘤细胞的染色体异常研究、体细胞中肿瘤基因和肿瘤抑制基因突变的研究及检测RNA或DNA肿瘤病毒。
 
　　人的恶性肿瘤发生与染色体基因错位、癌抑制基因的生活及各种与癌相关联的基因异常等有直接关系,因此PCR技术成为检出剖析恶性肿瘤遗传基因异常的有力手段。咽、喉部良性和恶性肿瘤及鼻移行上皮乳头状瘤与乳头状瘤病毒基因有关,利用PCR扩增结合探针技术可发现细胞(原)癌基因与抑癌基因的突变和某些恶性肿瘤有关(如乳腺癌、肺癌、大肠癌、肝癌、白血病等)。
 
4.2  在其他领域的应用
 
4.2.1  法学鉴定  目前通过PCR技术已成功地检测了各种生物材料的DNA,包括头发，精液，血迹，尿液，骨片，唾液和福尔马林固定、石蜡包埋的组织等。对这些犯罪现场的生物材料的鉴定为法医提供可靠有效的依据及直接、高效率的数据。
 
　　在司法程序中，通过PCR收集的信息可以作为法庭证据，如利用PCR可以从犯罪现场遗留的头发或血迹中扩增DNA,而确定一些细节特征。因为它可以提供个体独特的DNA片段样本，通过扩增，不同的DNA片段在电泳上呈现不同的带形。从理论上讲，它提供了一个人区别于另一个人独特的基因型。
 
　　PCR技术还可用于亲子鉴定。通过扩增和分析HLA-DQ基因,可以进行父系血统的验证和家族关系的确定。通过检查线粒体DNA，可以确认母系关系。
 
4.2.2  “重建”过去的生物  通过对一些古老组织提取物(如骨髓、化石以及博物馆中保存的皮肤制品、叶片等)中少数完整分子的扩增和研究,可追溯生物的地质年代起源并真正跟踪一个物种变异的过程。
 
　　PCR的问世，使从古生物化石中直接提取并分析DNA分子成为现实，由此可以研究古生物的遗传结构。由于PCR技术可以将古生物遗骸中残存的极少量的DNA分子在短时间内扩增到足以进行分析的程度，因此，它使所分析材料的范围从博物馆标本、动物尸体的软组织等扩大到琥珀及保护在地层中的动、植物化石，使材料的距今时间超过1亿年。
 
4.2.3  非生物学方面的应用  DNA的初级结构核苷酸序列具有极丰富的信息含量，利用PCR扩增，可以从非常少的DNA原始材料中获取信息，使其在作为商业产品的亚显微标志或标志物方面有广泛应用。如在对伪造产品的检测、污染源的追踪调查等方面，都可通过PCR技术来鉴定。对于环保主义者来说，PCR技术可以帮助确认被保护物种的身体各部分,如非法收集的象牙等。科学家可以用PCR技术监控基因工程菌株在自然环境中的生理、生态特点，检测转入的外源基因是否在环境中扩散。这种检测是将基因工程菌株大规模释放到环境中之前必须要进行的生物安全性检测。PCR技术还可用于检测饮用水中极少量的病原体等［6，7，8］。
 
5  PCR生物芯片
 
　　基于20世纪80年代中期提出的分子细胞器件(Molecular Cellular Device)概念，随着生物工程和技术学科的发展，到20世纪90年代最终演进定型为一个新的概念——生物芯片(Biochip)。作为一种重要的分析技术,生物芯片是将生化分析的许多过程与步骤,缩微集片(Biochip)。作为一种重要的分析技术，生物芯片是将生化分析的许多过程与步骤，缩微集成在不超过人手掌大小的一片状固体支持物上来完成。生物芯片作为新型集成化的生物功能器件，具有强大的功能和显著的优点。
 
　　(1)功能整合度高。 可对生化反应的过程动态检测；可进行基因点突变及多态性检测；可以借助靶标基因分析在分子水平上进行药物设计和新药开发。
 
　　(2)技术优点明显。 相对于传统生化分析方法，生物芯片技术具有消耗样品少、污染小的特点。
 
　　(3)应用范围广。 在基因表达谱分析、基因测序、突变检验、疾病诊断、司法鉴定、化工生产检测、环境分析、食品检验、卫生防疫、兴奋剂检查等方面具有广阔的应用前景。
 
　　(4)辐射带动功能强。作为分析化学、 环境化学、生物化学、化工生产的重要技术硬件平台工具，生物芯片将极大地带动其他相关技术的发展。
 
　　正是基于这些特点，生物芯片的研制开发与应用具有广阔的发展空间。在生物芯片的发展过程中，具有兼容生化反应的微流体类芯片是下一代生物芯片的发展方向。目前在微流体类芯片中，具有能将微量生物样品中含量较小(低拷贝数)的目标基因在引物作用下进行大量扩增的PCR生物芯片,是最具有广泛实用前景的芯片类型。
 
　　根据常规PCR扩增的原理,进行PCR反应需要采用专门的PCR仪，配备其他辅助处理设备如高速离心机、样品加注器、分配器等来完成，并经过多次操作和较长时间的反应等待过程来完成。而利用芯片分析方法来完成PCR技术,在原理上和常规PCR方法一致，但具体的实现硬件是采用了缩微芯片而并非专门的PCR扩增仪。这样不仅使分析用量减少，而且可以实现精确和可调的反应过程，使基因拷贝数得到较大程度的提高。因此，研究开发PCR生物芯片具有很高的应用价值。
 
　　PCR生物芯片的原理是把PCR过程结合的热循环仪中，以生长有惰性氧化层的薄片制作的反应器构成反应室,成为一次性PCR芯片。它具有反应体积小，加热率高，热循环时间短，高通量等特点。
 
　　1994年,Wilding等首先开展了用生物芯片进行PCR扩增及相关检测的研究。他们在玻璃片基上刻蚀出40～80μm深,可容纳5～10μl样品的微通道和反应室，构成一次性PCR生物芯片，在热循环仪中达到了扩增目的。以后,Shoffner等发现用加热法在片基上生成惰性氧化层能提高实验成功率；Taylor等设计的芯片扩增体积只要0.5μl,热循环时间比常规PCR少5倍而效率及特异性保持不变；在Kopp等的芯片中，样品可在不同温度的恒温区间内流动，经20个循环，扩增了淋病奈瑟球菌176bp的DNA。Wilding等则把硅基显微滤器反应室用于细胞分离与PCR扩增，他们利用刻蚀在硅片上的一系列3.5μm大小的水坝式微过滤器，从全血细胞中分离出白细胞，直接在芯片上加热裂解，释放DNA，扩增出肌营养不良蛋白基因外显子6的202bp序列。这是典型的细胞分离和PCR扩增双功能微生物芯片［9］。
 
　　PCR生物芯片已成功地用来从细菌基因组扩增出114Kb的产物[10]。利用同一系统,还进行了一系列不同的核酸扩增反应、反转录PCR、连接PCR和多重PCR。它是不需要任何辅助设备的一次性微型PCR反应器,可以形成整个生化分析过程的微型分析系统(Micro total analytical system)或微型芯片实验室(Lab on a chip)。 在PCR芯片上，通过分离核酸、 PCR扩增、杂交检测三个步骤成功地检测出大肠杆菌的DNA。PCR芯片可以用通道与毛细管电泳芯片连接，使扩增产物得到快速高分辨率的分离,已有人用此装置进行了人类基因组分析［11］。在今年发生SARS疫情的时候，使用PCR芯片及组织原位杂交可以对病毒抗原进行检测［12］。此外，一些研究者们还提出了研制纳米PCR生物芯片，它将比目前的PCR芯片在空间尺度上小三个数量级，反应所需求的材料以及起始样品量将大幅度减少，由于芯片的微型化，其热循环效率也必将大大提高。