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| 摘要 目的 探讨肺癌患者痰液K-ras基因表达的临床意义。方法 采用聚合酶链反应-单链构象多肽性分析(PCR-SSCP)方法检测55例经病检确诊的肺癌患者痰液中K-ras基因突变率。结果 55例肺癌患者痰液中K-ras基因突变率为40.0%。23例肺部良性疾病患者K-ras基因突变率为8.7%，二组之间比较有显著性差异（P<0.01）。基因变突与肿瘤组织类型、临床分期及是否化疗无显著差异(P>0.05)，与吸烟有显著差异性(P<0.05)。结论 K-ras基因突变是肺癌发生和发展一个重要因素，痰液检测无创、简便。 关键词 痰液 肺癌 基因 K-ras 研究表明基因突变是肺癌发生的早期事件，可能成为肺癌早期诊断的标志物［1］。痰液中有支气管肺组织的脱落细胞,肺癌或癌前病变产生的癌细胞可随痰液咳出。本研究的目的在于从肿瘤分子生物学角度探讨肺癌患者痰液细胞中K-ras基因突变对肺癌发生、发展及早期诊断、治疗、预后的影响。 1 材料与方法 1.1 研究对象 本院自2000年1月～今年12月住院及门诊经病检确诊的肺癌患者55例，其中男性41例，女性14例，平均年龄63.7岁。所有患者均进行询问病史、临床查体、胸片、胸部CT、腹部CT及同位素骨扫描，并根据1999年国际抗癌联盟(UICC)分期标准进行TNM分期。 对照组为23例经临床、影像学及病理活检确诊的肺部良性疾病患者。 1.2 痰标本留取及保存 取清晨漱口后深部第2、3口痰于无菌瓶中，部分患者于纤支镜检查后留痰，-40℃冰箱保存备用。 1.3 检测K-ras基因的PCR-SSCP方法 1.3.1 DNA提取 标本用1mol/L NaOH液化6～8小时，生理盐水冲洗2次，13000转/分离心10分钟，制备脱落细胞及游离核酸富集，蛋白酶K消化6小时，用酚-氯仿提纯DNA，75%乙醇冲洗3次，TE液溶解后备用。 1.3.2 PCR扩增 K-ras基因扩增物为密码子12、61，均由上海生工生物工程公司合成。PCR反应体系总体积为50μl,10×PCR缓冲液5μl,4种dNTP200μmol/L,primer-l、2各35pmol模板5μl,Taq聚合酶2U,石蜡油覆盖。循环参数为92.5℃ 1 min,72℃ 1 min，55℃ 1 min，72℃ 1 min循环35次，最后72℃保温10 min。 1.3.3 变性 取PCR扩增产物10μl，加热55℃变性5min。 1.3.4 电泳 取10μl变性产物加样与8%聚丙烯酰胺凝胶，垂直10～20V电泳3小时。 1.3.5 染色 取出凝胶置于0.5μg/ml溴化乙淀中染色30min，紫外灯下观察。 1.3.6 结果判定 与正常人痰液中提取的DNA扩增产物对比，出现条带位置或数量异常者判断为相应外显子发生了碱基改变。 1.4 统计学处理 所有统计学处理均采用SPSS 10.0 统计学软件进行。 2 结果 2.1 肺癌患者痰中K-ras基因突变率为40.0%(22/55),对照组为8.7%(2/32)，两组比较有显著性差异(P<0.01)。 2.2 55例肺癌患者中鳞癌30例,腺癌11例，小细胞肺癌14例，其K-ras基因突变率分别33.3%、36.4%和57.1%，各病理类型之间比较无显著性差异(P>0.05)。 2.3 55例肺癌患者中Ⅰ期8例,Ⅱ期18例，Ⅲ期21例，Ⅳ期8例，其K-ras基因突变率分别为42.8%、38.9%、38.1%、和50.0%，各临床分期之间比较无显著性差异(P>0.05)。 2.4 55例肺癌患者中吸烟者36例，K-ras基因突变率为50%(18/36)，与不吸烟者21.1%(4/19)比较有显著性差异(P<0.05)；化疗者17例，K-ras基因突变率为47.1%(8/17)，与未化疗组36.8%(14/88)比较无显著性差异(P>0.05)。 3 讨论 癌症的发生是一个多步骤、多阶段的过程，它是以多个原癌基因的激活和抑癌基因的失活为基础的，因此原癌基因的激活在肺癌的发生中是不容忽视的。与人类肿瘤尤其是肺癌有关的原癌基因主要是K-ras基因，它定位于12号染色体中，其突变位点主要在12、13和61位密码子。 我们采用PCR-SSCP方法对K-ras基因进行检测,结果显示55例经病理确诊的肺癌患者中有22例发生K-ras基因突变，证实原癌基因的突变也是肺癌的发生环节之一。 有报道K-ras基因突突变主要发生在非小细胞肺癌，其中以12位密码子突变率最高［2］，且腺癌高于鳞癌［3］，但本研究结果显示腺癌与其它肺癌病理类型比较无显著差异性，提示不同肿瘤发生恶变的机理大致是一致的，都是由多基因，多因素的综合作用所致。从临床分期来看，基因突变与肿瘤的病变范围无关，而重要的是与肿瘤是否形成即是否有肿瘤有关，这一点对肺癌的早期诊断、确定病变的性质有一定的作用。对于有基因突变的患者应警惕肿瘤的发生，应跟踪随访,努力寻找病理依据,以争取早期诊断。吸烟与肺癌的关系已被人们广泛认识,本组吸烟与非吸烟二组比较有显著差异性，提示吸烟是导致支气管黏膜基因突变的主要原因之一。对于是否化疗并不影响基因突变，提示化疗对肿瘤的治疗干预只是细胞水平的，并没有从分子病因水平进行干预，这也许就是为什么化疗不能根治肿瘤、患者容易复发及有基因突变者化疗欠佳的原因所在。 参考文献 1 Minna JD,Sekido Y,Fong KM,et al.Philadelphia:Lippincott,1997:849-950 2 Ronai Z,Yabubovskaya MS,Zhang E,et al.T Cell,Biochem Suppl,1996,25:172-176 3 Crazians JL,Gamble GB,Newman NB,et al.J Clin Onco，1999,17(2):668-675 |
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